Pod redakcją Petera Sarnowa, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalifornia, zatwierdzono 25 grudnia 2020 r. (sprawdzono 25 października 2020 r.)
Opisujemy interakcję między podjednostkami w replikacji kompleksów transkrypcyjnych koronawirusów, które są niezbędne do replikacji i ewolucyjnej ochrony.Dostarczyliśmy dowody na to, że domena NiRAN związana z nsp12 ma aktywność transferazy monofosforanu nukleozydu (NMP) w trans i zidentyfikowaliśmy nsp9 (białko wiążące RNA) jako swój cel.NiRAN katalizuje kowalencyjne przyłączenie ugrupowania NMP do konserwatywnego końca aminowego nsp9 w reakcji, która opiera się na jonach Mn2+ i sąsiadujących konserwatywnych resztach Asn.Stwierdzono, że aktywność NiRAN i NMPylacja nsp9 są niezbędne do replikacji wirusa.Dane pozwalają nam powiązać tę aktywność markera enzymatycznego zagnieżdżonego wirusa z wcześniejszymi obserwacjami dotyczącymi hipotezy, że inicjacja syntezy RNA w klasie wirusów RNA jest funkcjonalnie i ewolucyjnie spójna.
Zależna od RNA polimeraza RNA (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae i 12 innych rodzin) jest połączona z domeną N-końcową (N-końcową) w białku niestrukturalnym (nsp) uwalnianym z poliproteiny, zwanym NiRAN 1ab składa się z głównej proteazy wirusowej (Mpro).Wcześniej donoszono o własnej aktywności GMPylacji/UMPilacji wirusa tętniczego NiRAN-RdRp nsp i zasugerowano wygenerowanie stanu przejściowego dla przeniesienia monofosforanu nukleozydu (NMP) do (obecnie nieznanego) wirusa i/lub elementów biopolimeryzacji komórek.Tutaj pokazujemy, że koronawirus (ludzki koronawirus [HCoV]-229E i koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ma zależną od Mn2+ aktywność NMPylację, która pochodzi z nsp9 poprzez tworzenie nsp9 za pośrednictwem Mpro. N-końcowy flankujący nsp jest uwalniany proteolitycznie, fosforoamidan jest związany z aminą pierwszorzędową (N3825) na N-końcu nsp9.Trifosforan urydyny jest korzystnym nukleotydem w tej reakcji, ale odpowiednimi kosubstratami są także trifosforan adenozyny, trifosforan guanozyny i trifosforan cytydyny.Badania mutacji z wykorzystaniem rekombinowanych białek nsp9 i nsp12 wirusa koronowego oraz genetycznie zmodyfikowanych mutantów HCoV-229E pozwoliły określić reszty niezbędne do NMPylacji nsp9 za pośrednictwem NiRAN i replikacji wirusa w hodowli komórkowej.Dane potwierdziły przewidywania dotyczące reszt miejsca aktywnego NiRAN i określiły ważną rolę reszt N3826 nsp9 w NMPylacji nsp9 i replikacji wirusa in vitro.Reszta ta jest częścią konserwatywnej N-końcowej sekwencji tripeptydu NNE i okazała się jedyną niezmienną resztą nsp9 i jej homologów w rodzinie koronawirusów.Badanie to zapewnia solidne podstawy do badań funkcjonalnych aktywności NMPylacji innych zagnieżdżonych wirusów i proponuje możliwe cele dla rozwoju leków przeciwwirusowych.
Wirus Nidovirales z dodatnią nicią RNA infekuje różnorodne kręgowce i bezkręgowce (1, 2).Zamówienie obejmuje obecnie 14 rodzin (3), z których rodzina koronawirusów była szeroko badana w ciągu ostatnich 20 lat.W tym czasie od zwierząt żywicielskich wyłoniły się trzy odzwierzęce koronawirusy, które spowodowały epidemie na dużą skalę ciężkich infekcji dróg oddechowych u ludzi.W tym utrzymujące się pandemie spowodowane ciężkimi ostrymi chorobami zakaźnymi.Zespół oddechowy Koronawirus 2 (SARS-CoV-2) (4–7).Nidowirusy mają wspólną organizację genomu, a podjednostka związanego z błoną kompleksu replikacyjno-transkrypcyjnego (RTC) jest kodowana w dwóch trzecich na końcu 5-?² i głównej podjednostce strukturalnej cząstki wirusa, a także w niektórych akcesoriach .Białko kodowane w trzeciej trzeciej części genomu (1).Z wyjątkiem jednej rodziny wirusów planarnych (Monoviridae) (8), wszystkie wirusy zagnieżdżone kodują podjednostki RTC w dwóch dużych otwartych ramkach odczytu (ORF) ORF1a i ORF1b, które ulegają translacji z genomowego RNA.ORF1a koduje polibiałko (pp) 1a, a ORF1a i ORF1b wspólnie kodują pp1ab.Przy ogólnym udziale głównej proteazy (Mpro) kodowanej przez ORF1a, zarówno pp1a, jak i pp1ab są przetwarzane proteolitycznie do różnych białek niestrukturalnych (nsps), znanych również jako 3CLpro, ponieważ wykazuje homologię z 3Cpro pikornawirusa ( 9).Uważa się, że te nsp składają się w duży dynamiczny RTC, katalizują syntezę genomowego RNA (replikacja) i zestawu subgenomowego RNA (transkrypcja) i są wykorzystywane do koordynowania ekspresji ORF zlokalizowanej poniżej ORF1b (10? ?12).
Rdzeń RTC obejmuje zależną od RNA polimerazę RNA (RdRp) (13), helikazę nadrodziny 1 (HEL1) (14, 15) i kilka enzymów przetwarzających RNA, które są kodowane głównie w ORF1b i rodzinie koronawirusów. Zawiera nsp12-nsp16 i nsp9-nsp12 z rodziny Arterioviridae (patrz odnośniki 10–12).RdRp i HEL1 reprezentują dwie (jedną piątą) konserwatywne domeny wirusa ptasiego gniazda i wykazują homologię z innymi wirusami RNA.Uważa się, że replikaza rdzeniowa jest wspomagana przez inne podjednostki, w tym kilka małych nsp uwalnianych z regionu C-końcowego (C-końcowego) pp1a, poniżej Mpro (odpowiednio koronawirus nsp5 i wirus tętniczy nsp4).Mają ograniczoną ochronę specyficzną dla rodziny i różnorodne działania (przegląd w odnośnikach 10–12).
Stosunkowo niedawno odkryto domenę o unikalnej charakterystyce motywu sekwencji na końcu aminowym (końcu N) w sąsiedztwie RdRp we wszystkich wirusach zagnieżdżonych, ale nie w innych wirusach RNA (16).W oparciu o jej lokalizację i aktywność transferazy nukleotydowej (transferazy monofosforanu nukleozydu [NMP]), domena ta została nazwana NiRAN (transferaza nukleotydowa związana z Nestvirus RdRp).Dwudomenowa kombinacja NiRAN-RdRp tworzy nsp12 z rodziny Coronaviridae i nsp9 z rodziny Arterioviridae, a u innych Nestoviridae oczekuje się, że NiRAN-RdRp będzie uwalniany jako niezależny nsp z wirusowej poliproteiny.W koronawirusie domena NiRAN zawiera reszty A1/450 i jest połączona z C-końcową domeną RdRp poprzez region łącznikowy (16?19).W wirusie zapalenia tętnic koni (EAV) (Arteriviridae) rekombinowany nsp9 wykazuje zależną od jonów Mn2+ (samo) aktywność UMPylacji i GMPylacji, która zależy od trzech konserwatywnych zasad sekwencji w wirusach gniazdowych: AN, BN i CN. Reszty w sekwencji.Gdzie N oznacza NiRAN) (16).N-końcowe flankowanie tych motywów jest mniej konserwatywnym motywem preAN.Niektóre z tych reszt są również konserwatywne w odlegle spokrewnionych kinazach białkowych, gdzie wykazano, że biorą udział w wiązaniu trifosforanu nukleozydu (NTP) i aktywności katalitycznej (20, 21).Zgodnie z tą obserwacją, kilka kluczowych reszt miejsca aktywnego w pseudokinazie SelO z Pseudomonas syringae można złożyć z niedawno opublikowanym superkompleksem SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Konserwatywne reszty NiRAN wirusa koronowego nałożone na mikrostrukturę elektronową.Białko rekombinowane (17).Spekuluje się, że udokumentowana (samo)U/GMPilacja wytworzy stan przejściowy umożliwiający przeniesienie NMP na (obecnie nieznany) substrat (16) oraz podobieństwo strukturalne pomiędzy NiRAN i kinazą białkową (17, 19) ). Czy hipoteza głosi, że NiRAN modyfikuje inne białka.
Wiele cech, w tym unikalne i unikalne systematyczne powiązanie z wirusami zagnieżdżonymi oraz genetyczna separacja od RdRp, czyni NiRAN rozsądnym kluczowym enzymem regulatorowym dla wirusów zagnieżdżonych, co ma kluczowe znaczenie dla ich pojawienia się i tożsamości.Wcześniej wywoływano trzy możliwe funkcje obejmujące NiRAN do regulacji translacji genomu/subgenomu lub replikacji/transkrypcji.Biorąc pod uwagę skąpe i niekompletne dane dostępne w tamtym czasie, każda funkcja ma swoje zalety i wady (16).W tych badaniach naszym celem jest połączenie badań biochemicznych i odwrotnych badań genetycznych koronawirusów reprezentujących dwa rodzaje i umieszczenie naszych odkryć na tle ewolucyjnym naturalnej mutacji rodziny koronawirusów, aby uzyskać wgląd w tę Tajemniczą sferę.Zgłaszamy znaczny postęp w zrozumieniu NiRAN poprzez identyfikację naturalnych celów w RTC, co (wśród trzech dostępnych hipotez) przyczynia się do roli tej domeny w inicjowaniu syntezy zagnieżdżonego RNA wirusa.Badania te otwierają również możliwości dla innych ról NiRAN w interfejsie hosta wirusa.
W celu scharakteryzowania właściwości enzymatycznych domeny NiRAN związanej z wirusem koronowym nsp12, wyprodukowaliśmy rekombinowaną formę ludzkiego wirusa koronowego 229E (HCoV-229E) nsp12 w E. coli, ze znacznikiem His6 na C-końcu i połączyliśmy białko z [α32-P] Inkubować razem z NTP w obecności MnCl2 jak opisano w Materiałach i Metodach.Analiza produktu reakcji wykazała obecność znakowanego radioaktywnie białka migrującego wspólnie z nsp12 (106 kDa), co wskazuje, że koronawirus nsp12 katalizuje tworzenie kowalencyjnych adduktów białko-NMP, utworzonych preferencyjnie z monofosforanem urydyny (UMP) (Rysunek 1A). B).Analiza ilościowa wykazała, że w porównaniu z innymi nukleotydami intensywność sygnału wbudowania UMP wzrosła 2 do 3 razy (Figura 1C).Dane te są zgodne z przewidywaną aktywnością transferazy NMP domeny NiRAN koronaawirusa (16), ale wskazują, że preferencje nukleotydowe domeny NiRAN koronaawirusa i wirusa tętniczego są różne.
Aktywność auto-NMPylacji HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) inkubowano z oznaczonym [α-32P] NTP w obecności 6 mM MnCl2 przez 30 minut (szczegóły patrz Materiały i metody).Produkty reakcji rozdzielono metodą SDS-PAGE i wybarwiono błękitem brylantowym Coomassie.(B) Wyznakowane radioaktywnie białko uwidoczniono za pomocą obrazowania fosforowego.Pozycje nsp12-His6 i markerów masy cząsteczkowej białka (w kilodaltonach) pokazano w A i B. (C) Intensywność sygnału radioaktywnego (średnia ± SEM) określono na podstawie trzech niezależnych eksperymentów.*P≤0,05.Siła sygnału (w procentach) jest związana z UTP.
Chociaż wykazano, że aktywność enzymów związana z NiRAN jest niezbędna do replikacji EAV i SARS-CoV w hodowli komórkowej (16), specyficzna funkcja NiRAN i potencjalne cele nie zostały jeszcze określone.Niedawno zgłoszone podobieństwo strukturalne między NiRAN a rodziną białek z fałdami podobnymi do kinaz białkowych (17, 22) skłoniło nas do przetestowania hipotezy, że NiRAN katalizuje NMPylację innych białek.Wygenerowaliśmy zestaw potencjalnych homologicznych celów, w tym białka niestrukturalne kodowane przez HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), każdy zawierający C-końcowy znacznik His6 (załącznik SI, tabela S1), oraz inkubować te białka z trifosforanem [α32-P]urydyny ([α32-P]UTP) w obecności lub nieobecności nsp12.Albumina surowicy bydlęcej i białko fuzyjne MBP-LacZα wytwarzane w E. coli służyły jako kontrole (Figura 2A, ścieżki 1 do 7).Wyznakowane radioaktywnie białko analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i autoradiografii i stwierdzono, że w reakcji zawierającej nsp12 i nsp9 występował silny sygnał radioaktywny.Pozycja sygnału odpowiada masie cząsteczkowej nsp9, co wskazuje na UMPylację nsp9 za pośrednictwem nsp12 (Figura 2B, ścieżka 7).Żadne inne białka testowe nie okazały się UMPylowane, co doprowadziło nas do wniosku, że nsp9 jest specyficznym substratem nsp12.Zgodnie z danymi samo-NMPylacji pokazanymi na rysunku 1, nsp12 jest w stanie przenieść wszystkie cztery NMP do nsp9, chociaż wydajność jest inna, UMP> monofosforan adenozyny (AMP)> monofosforan guanozyny (GMP)> monofosforan cytydyny (CMP)) ( Zdjęcie).3 A i B).W warunkach stosowanych w tym teście (skrócenie czasu reakcji i ekspozycji, zmniejszenie stężenia nsp12; materiały i metody) nie można było wykryć samo-NMPylacji nsp12 (porównaj Rysunek 2B, ścieżka 7 i Rysunek 1B), co okazał się skutecznym (i wieloma rundami) UMP przeniesiony z nsp12 do nsp9.Aktywność transferazy UMP wymaga obecności jonów Mn2+, jak pokazano na Figurze 3C, podczas gdy zaobserwowano jedynie minimalną aktywność transferazy UMP w obecności Mg2+ i brak aktywności w obecności pozostałych dwóch badanych kationów dwuwartościowych.Podobne dane uzyskano w testach NMPylacji zawierających trifosforan cytydyny (CTP), trifosforan guanozyny (GTP) i trifosforan adenozyny (ATP) (załącznik SI, rysunek S1).
HCoV-229E UMPylacja nsp9 za pośrednictwem nsp12.Szereg substratów białkowych (w tym albumina surowicy bydlęcej, MBP-lacZα i seria HCoV-229E nsp znakowanych C-końcowym His6 kodowanym przez ORF1a) zastosowano do oceny aktywności UMPylacji HCoV-229E za pośrednictwem nsp12-His6⁺ białko.Inkubować białko z [α-32P] UTP przez 10 minut w nieobecności (A) lub w obecności (B) nsp12, jak opisano w materiałach i metodach.Na górze A i B pokazano żel poliakryloamidowy SDS wybarwiony błękitem Coomassie Brilliant Blue, a na dole A i B pokazano odpowiednie autoradiogramy.Po lewej stronie podano położenie znacznika masy cząsteczkowej białka (w kilodaltonach).Wskazano także pozycję nsp12-His6 (B, góra) i sygnał radioaktywny obserwowany podczas inkubacji nsp12-His6 z nsp9-His6 (B, ścieżka 7), co wskazuje, że [α-32P]UMP do nsp9-His6 (12,9 kDa), czego nie zaobserwowano w przypadku innych badanych białek.
HCoV-229E Biochemiczna i wirusologiczna charakterystyka NMPylacji nsp9 za pośrednictwem NiRAN.(A i B) Rola kosubstratu nukleotydowego użytego w reakcji.Nsp12-His6 i nsp9-His6 miesza się i inkubuje w obecności różnych [α-32P] NTP w standardowym teście NMPylacji.(A, góra) nsp9-His6 barwione Coomassie oddzielone za pomocą SDS-PAGE.(A, dół) Autoriogram tego samego obszaru żelu.(B) Aktywność względną (średnia ± SEM) w obecności wyznaczonego kofaktora nukleotydowego określa się na podstawie trzech niezależnych eksperymentów.*P≤0,05.(C) Rola jonów metali.Pokazano standardowy test NMPylacji w obecności [α-32P] UTP i różnych jonów metali, każdy w stężeniu 1 mM.W C, na górze pokazano nsp9-His6 barwione Coomassie, a w C, na dole, pokazano odpowiednią autoradiografię.Rozmiar znakowanego białka (w kilodaltonach) pokazano na lewo od A i C. (D) Zmutowana postać HCoV-229E nsp12-His6 niosąca określone podstawienie aminokwasu znajduje się w [α-32P]UTP, jak opisano w Materiałach i metodach.Znakowany radioaktywnie nsp9-His6 wytwarzany w reakcji NMPylacji wykrywa się za pomocą obrazowania fosforylacji (D, góra).Aktywność względną w porównaniu z białkiem typu dzikiego (wt) pokazano w D, a dół przyjęto jako średnią (±SEM) z trzech niezależnych eksperymentów.Gwiazdki wskazują podstawienia reszt niekonserwatywnych.(E) Miano wirusa w supernatancie hodowli komórek p1 otrzymanym 24 godziny po zakażeniu określono za pomocą testu łysinkowego.Wskazano podstawienia kodonów w domenie NiRAN zmodyfikowanego mutanta HCoV-229E (numeracja reszt opiera się na ich pozycji w pp1ab).Jako kontrolę zastosowano pozbawionego replikacji mutanta miejsca aktywnego RdRp nsp12_DD4823/4AA.
W celu głębszego zrozumienia miejsca aktywnego NiRAN i określenia reszt związanych z aktywnością transferazy NMP specyficznej dla nsp9 przeprowadziliśmy analizę mutacji, w której zastąpiliśmy reszty konserwatywne w motywach NiRAN AN, BN i CN ( 16) Jest to Ala (załącznik SI, rysunek S2).Ponadto w dwóch przypadkach oceniano wpływ konserwatywnych podstawień Arg-to-Lys lub Lys-Arg.Jako kontrolę (negatywną) reszty, które nie są lub są mniej konserwatywne w domenie NiRAN koronawirusów i innych wirusów zagnieżdżonych, zastępuje się Ala. Zastępując K4116A (w motywie preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motyw BN) i D4280A (CN) znacząco zmniejszają lub nawet eliminują NMPylację nsp9 poprzez nsp12, natomiast białka z podstawieniami konserwatywnymi (R4178K), K4116R) zachowują 60% i 80% swojej aktywności, co wskazuje, że złagodzenie ograniczeń po ich stronie łańcuchy są wrażliwe fizykochemicznie (rysunek 3D).Zastąpienie kilku innych konserwatywnych reszt E4145A, D4273A, F4281A i D4283A jest znacznie mniej szkodliwe, a UMPylacja nsp9 jest tylko umiarkowanie zmniejszona.Podobne wyniki uzyskano w reakcjach NMPylacji nsp9 z udziałem innych NTP (Rysunek 3D i dodatek SI, Rysunek S3), potwierdzając, że obserwowany wpływ na określone podstawienia aminokwasów jest niezależny od rodzaju zastosowanego kosubstratu nukleotydowego.Następnie przetestowaliśmy możliwy wpływ tych podstawień nsp12 na replikację koronawirusów w hodowli komórkowej.W tym celu zastosowaliśmy odpowiednie, zmodyfikowane genetycznie matryce komplementarnego DNA (cDNA) sklonowane w rekombinowanym wirusie krowianki (23, 24) w celu transkrypcji 5-7 komórek.Miareczkowanie potomstwa zakaźnego wirusa wytwarzanego w tych komórkach wykazało, że większość mutantów NiRAN HCoV-229E nie była możliwa (Figura 3E).Grupa nieżywotnych mutantów wirusowych obejmuje alternatywy, w przypadku których wykazano, że eliminują lub znacząco zmniejszają aktywność transferazy NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ale istnieją dwie inne alternatywy (K4116R, E4145A) 80 % skryty?Ich aktywność NMPylacji in vitro sugeruje, że wiążą się z tym dodatkowe ograniczenia.Podobnie dwie inne mutacje (R4178K, F4281A), które spowodowały umiarkowany spadek aktywności NMPylacji NiRAN in vitro, dały żywe wirusy, jednakże wirusy te znacząco zmniejszyły miano poprzez replikację.Zgodnie z danymi dotyczącymi aktywności in vitro pokazanymi na Rycinie 3D, zastąpienie czterech innych reszt, które nie są konserwatywne w koronawirusie i/lub innych wirusach zagnieżdżonych (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) wytworzyło żywotne wirusy. Potomstwo, pomimo posiadania umiarkowanie zmniejszone miano w porównaniu z wirusem typu dzikiego (Figura 3E).
W celu zbadania, czy aktywność transferazy NMP za pośrednictwem NiRAN zależy od aktywnej domeny RdRp, dwie konserwatywne reszty Asp zaangażowane w koordynację jonów metali dwuwartościowych (11) w motywie C RdRp zastąpiono Ala. Powstałe białko nsp12_DD4823/4AA zachowuje jego aktywność NMPylacji nsp9, wskazując, że aktywność NMPylacji nsp9 in vitro za pośrednictwem nsp12 nie wymaga aktywności polimerazy (Załącznik SI, Rysunek S4).
Po ustaleniu specyficznej dla nsp9 aktywności transferazy NMP dla nsp12, próbowaliśmy scharakteryzować addukt NMP-nsp9 za pomocą spektrometrii mas (MS).Pełne widmo masowe białka rekombinowanego HCoV-229E nsp9 wykazało pik przy 12045 Da (Figura 4A).Dodatek nsp12 nie zmienił jakości nsp9, co wskazuje, że nsp12 i nsp9 nie utworzą stabilnego kompleksu w zastosowanych warunkach (denaturacja) (Rysunek 4A).W obecności UTP i GTP pomiar masy reakcji zawierającej odpowiednio nsp9 i nsp12 wykazał, że masa białka UTP przesunęła się o 306 Da, a masa białka GTP przesunęła się o 345 Da, co wskazuje, że każda cząsteczka nsp9 wiąże się z UMP lub GMP (Rysunek 4) C i D).Spekuluje się, że energia wymagana do NMPylacji nsp9 za pośrednictwem NiRAN pochodzi z hydrolizy NTP i uwalniania pirofosforanu.Chociaż w tej reakcji użyto 10-krotny nadmiar molowy nsp9 (docelowy) niż nsp12 (enzym), zaobserwowano prawie całkowitą NMPylację nsp9, co wskazuje, że interakcja między nsp12 i nsp9 jest krótkotrwała, a nsp12 może NMPylować więcej nsp9 cząsteczka in vitro.
Pojedyncza NMPylacja nsp9 w obecności nsp12 i UTP lub GTP.Pokazano zdekonwoluowane pełne widmo masowe białka HCoV-229E nsp9 (dodatek SI, tabela S1) (AD).(A) sam nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 w obecności UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 w obecności GTP.
Aby określić reszty nsp9 UMPilowane przez nsp12, nsp9-UMP rozszczepiono trypsyną.Powstałe peptydy rozdzielono za pomocą nanowysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i analizowano za pomocą tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) online.Analiza danych przy użyciu pakietu oprogramowania Byonic (Protein Metrics) wykazała UMPylację N-końcowego aminokwasu.Jest to potwierdzane ręcznie.Tandemowe widmo masowe peptydu prekursorowego [UMP]NNEIMPGK (załącznik SI, rysunek S5A) ujawniło fragment przy 421 m/z, co wskazuje, że UMP wiąże się z resztą 1 nsp9.
Na N-końcu nsp9 Asn jest konserwatywny wśród członków Orthocoronavirinae (dodatek SI, rysunek S6).Chociaż uważamy, że azot aminy pierwszorzędowej N-końcowej jest najbardziej prawdopodobnym akceptorem UMP, zdecydowaliśmy się uzyskać dodatkowe dowody wiązania NMP na końcu N.Z tego powodu nie-NMPylowany i NMPylowany N-końcowy peptyd nsp9 oczyszczony metodą HPLC otrzymano w obecności acetonu i cyjanoborowodorku sodu.W tych warunkach propylem można modyfikować jedynie wolne aminy pierwszorzędowe (25).N-końcowy peptyd pochodzący z nsp9 o sekwencji NNEIMPGK zawiera dwie pierwszorzędowe aminy, jedną na N-końcu Asn i drugą na bocznym łańcuchu Lys na C-końcu.Dlatego grupy propylowe można wprowadzić na obu końcach.Wyekstrahowane chromatogramy jonowe nie-NMPilowanych peptydów pokazano w dodatku SI, Rysunek S5B.Zgodnie z oczekiwaniami można zidentyfikować peptydy (mono)propylowane (mono)końcowe i C-końcowe (załącznik SI, rysunek S5B, górna ścieżka) i dipropylowane peptydy (załącznik SI, rysunek S5B, dolna ścieżka).Ten wzór zmienia się wraz z użyciem NMPylowanego N-końcowego peptydu nsp9.W tym przypadku można zidentyfikować tylko propylowane peptydy na C-końcu, ale nie zidentyfikowano peptydów propylowanych na końcu N i peptydów dipropylowanych (Załącznik SI, Rysunek S5C), co wskazuje, że UMP został przeniesiony do N-końcowej aminy pierwszorzędowej. Aby temu zapobiec grupę od wprowadzenia zmian.
Następnie zastępujemy (przez Ala lub Ser) lub usuwamy konserwatywne reszty na N-końcu nsp9, aby zdefiniować ograniczenia specyficzne dla celu.W oparciu o nasze dane MS pokazujące, że NiRAN tworzy addukt nsp9-NMP z aminą pierwszorzędową N-końcowej reszty nsp9, postawiliśmy hipotezę, że NMPylacja nsp9 wymaga głównej proteazy wirusowej (Mpro, nsp5) do uwolnienia N-końca nsp9 z jego prekursor poliproteinowy.Aby przetestować tę hipotezę, wyprodukowaliśmy białko prekursorowe nsp7-11 zawierające nsp9 w E. coli i przeprowadziliśmy standardowy test NMPylacji w obecności [α-32P] UTP (materiały i metody).Jak pokazano na Figurze 5A (ścieżka 3), niecięty prekursor nsp7-11 nie jest znakowany radioaktywnie nsp12.W przeciwieństwie do tego, jeśli nsp7-11 zostanie rozszczepiony przez rekombinowany nsp5 w celu uwolnienia nsp9 (i innych nsp) z prekursora, wykryte zostanie znakowane radioaktywnie białko, które migruje z nsp9, co potwierdza nasz wniosek, że NiRAN i N- Selektywne tworzenie kowalencyjnych adduktów nsp9-NMP .Terminalna pierwszorzędowa amina N-końcowego Asn (pozycja 3825 w pp1a/pp1ab).Wniosek ten potwierdzają także eksperymenty z użyciem konstruktu nsp9, który zawiera jedną lub dwie dodatkowe reszty na N-końcu.W obu przypadkach zniesiono UMPylację nsp9 za pośrednictwem NiRAN (załącznik SI, rysunek S7).Następnie wyprodukowaliśmy białko z jedną lub dwiema resztami Asn usuniętymi z sekwencji peptydu 3825-NNEIMPK-3832 na N-końcu nsp9.W obu przypadkach UMPylacja nsp9 została całkowicie zablokowana (Figura 5B), dostarczając dodatkowych dowodów na to, że prawdziwy N-koniec nsp9 działa jak receptor NMP.
Obróbka proteolityczna nsp9 i rola reszt N-końcowych w UMPylacji za pośrednictwem nsp12.(A) UMPylacja nsp9 wymaga wolnego N-końca nsp9.Nsp7-11-His6 wstępnie inkubuje się w temperaturze 30°C w buforze do wykrywania NMPylacji zawierającym UTP w obecności lub przy braku rekombinowanego Mpro (nsp5-His6).Po 3 godzinach rozpocznij test NMPylacji, dodając nsp12-His6, jak opisano w części Materiały i metody.Reakcję zawierającą nsp5-His6 (ścieżka 1) i nsp9-His6 (ścieżka 2) zastosowano jako kontrolę.Po 10 minutach reakcję zakończono i mieszaninę reakcyjną rozdzielono metodą SDS-PAGE.Białko barwiono błękitem brylantowym Coomassie (A, góra).Prekursor Nsp7-11-His6 i przetworzony produkt powstały w wyniku rozszczepienia za pośrednictwem nsp5-His6 pokazano po prawej stronie.Należy pamiętać (ze względu na ich mały rozmiar), że nsp7 i nsp11-His6 nie są wykrywalne w tym żelu, a reakcję uzupełnia się nsp5-His6 (ścieżki 1 i 4; pozycja nsp5-His6 jest oznaczona pełnym kółkiem) lub nsp9-His6 (ścieżka 2) zawiera niewielką ilość MBP (oznaczoną pustymi kółkami) jako resztkowe zanieczyszczenia, ponieważ są one wyrażone jako białka fuzyjne MBP (załącznik SI, tabela S1).(B) Wariant Nsp9-His6 nie zawiera jednej lub dwóch N-końcowych reszt Asn (numeracja reszt zgodnie z pozycją w pp1a/pp1ab) i jest oczyszczany i inkubowany z nsp12-His6 i [α-32P] UTP.B, na górze pokazano SDS-PAGE barwioną Coomassie, B, odpowiedni autoradiogram pokazano na dole.Położenie znacznika masy cząsteczkowej (w kilodaltonach) pokazano po lewej stronie.(C) HCoV-229E N-końcowe konserwatywne reszty nsp9-His6 zastąpiono Ala lub Ser i taką samą ilość białka użyto w reakcji UMPylacji za pośrednictwem nsp12-His6.Produkty reakcji rozdzielono za pomocą SDS-PAGE i wybarwiono błękitem brylantowym Coomassie (C, na górze), a znakowany radioaktywnie nsp9-His6 wykryto za pomocą obrazowania fosforescencyjnego (C, na środku).Stosując białko typu dzikiego (wt) jako odniesienie (ustawione na 100%), obliczono względną aktywność NMPylacji (średnia ± SEM) z trzech niezależnych eksperymentów.(D) Miana wirusa w supernatancie hodowli komórek p1 komórek Huh-7 zakażonych komórkami Huh-7 typu dzikiego HCoV-229E i mutantami niosącymi wyznaczone podstawienia aminokwasowe w nsp9 określono za pomocą testu łysinkowego.Jako kontrolę ujemną zastosowano motyw RdRp C, pozbawiony replikacji, podwójny mutant DD4823/4AA.
Koniec N nsp9 (szczególnie pozycje 1, 2, 3 i 6) jest bardzo konserwatywny wśród członków podrodziny Orthocoronavirinae (załącznik SI, rysunek S6).W celu zbadania możliwej roli tych reszt w NMPylacji nsp9 za pośrednictwem nsp12, dwie kolejne reszty Asn na N-końcu nsp9 zastąpiono Ala lub Ser (samodzielnie lub w kombinacji).W porównaniu z nsp9 typu dzikiego, zastąpienie N3825 Ala lub Ser spowodowało ponad dwukrotne zmniejszenie UMPylacji za pośrednictwem nsp12 (Figura 5C).Zgodnie z naszym wnioskiem, że NMPylacja zachodzi przy N-końcowej pierwszorzędowej aminie zamiast w łańcuchu bocznym reszty N-końcowej, zaobserwowaliśmy znaczącą resztkową NMPylację z zastąpieniem N3825A i N3825S.Co ciekawe, jeśli drugi Asn zostanie zastąpiony przez Ala lub Ser, UMPylacja nsp9 zostanie zmniejszona silniej (ponad 10 razy), podczas gdy zastąpienie Ala w pozycjach 3, 4 i 6 będzie miało jedynie umiarkowany wpływ na UMPylację nsp9 (Rysunek 2 ) .5C).Podobne wyniki uzyskano stosując ATP, CTP lub GTP (załącznik SI, rysunek S8).Łącznie dane te wskazują na kluczową rolę N2826 (pozycja 2 w nsp9) w NMPylacji nsp9.
W celu uzyskania dodatkowych dowodów na funkcjonalną korelację pomiędzy N-końcem nsp9 i NMPylacją, przeprowadziliśmy dopasowanie wielu sekwencji (MSA) sekwencji nsp9 z rodziny koronawirusów (wahającej się pomiędzy 104 a 113 resztami) (Załącznik SI, rysunek S6 ).W sumie u 47 (znanych i domniemanych) gatunków z 5 rodzajów podrodziny Orthocoronavirinae, które zakażają różne ssaki, ptaki i żywiciele gadów, w sumie tylko 8 reszt uznano za niezmienne.Najbardziej rozległe zmiany, w tym delecje i insercje, zaobserwowano w cyklach pomiędzy elementami struktury drugorzędowej nsp9, jak ustalono w poprzednich badaniach strukturalnych (26 ± 28).Znaleziono pięć niezmiennych reszt w nici β i helisie α części C-końcowej nsp9.Trzy niezmienne reszty stanowią motyw NNE N-końca nsp9.Okazało się, że druga Asn tego motywu jest jedyną niezmienną resztą, która jest również wspólna dla hipotetycznego nsp9 odlegle spokrewnionego żabiego koronawirusa i reprezentuje gatunek Microhyla letowirus 1 z podrodziny Letovirinae Alphaletowirusa.Konserwację reszt w elementach struktury drugorzędowej nsp9 można zracjonalizować względami strukturalnymi w celu utrzymania fałdowania lub znanych właściwości wiązania RNA.Jednakże to rozumowanie nie wydaje się mieć zastosowania do zachowania NNE, a przed tym badaniem charakter ograniczeń ograniczających zmienność sekwencji tripeptydowej był całkowicie niejasny.
Aby określić znaczenie nsp9-NMPylacji i konserwacji NNE w replikacji koronaawirusa, wyprodukowaliśmy mutanty HCoV-229E, które niosą pojedyncze lub podwójne podstawienia reszt N-końcowych nsp9, co wskazuje, że NMPylacja nsp9 jest szkodliwa in vitro.Zanim zaczniemy, staramy się odpowiedzieć na pytanie, czy te podstawienia (w pobliżu miejsca cięcia nsp8|9) wpływają na obróbkę proteolityczną C-końcowego regionu pp1a.Zestaw konstruktów polibiałkowych nsp7-11 zawierających odpowiednie podstawienia na N-końcu nsp9 wytworzono w E. coli i pocięto rekombinowanym Mpro.Żadne wprowadzone substytucje nie wpływają znacząco na rozszczepienie proteolityczne czterech miejsc (w tym miejsce flankujące nsp9) (załącznik SI, rysunek S9), z wyjątkiem zmian strukturalnych w tych białkach, które zakłócają rozszczepienie nsp8|9 za pośrednictwem Mpro (lub inne) strona internetowa.
Komórki Huh-7 transfekowano RNA HCoV-229E o długości genomu, kodującym podstawienia Ala lub Ser w konserwatywnych tripeptydach NNE (N3825, N3826 i E3827) na N-końcu nsp9, co pokazuje, że większość mutacji jest śmiertelna.Udało nam się uratować wirusa, zastępując Ser lub Ala N-końcowego Asn (N2835A lub N2835S), ale nie udało nam się odzyskać wirusa innymi pojedynczymi i podwójnymi mutacjami w sekwencji NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (rysunek 5D).
Wyniki te wskazują, że replikacja koronawirusów w hodowli tkankowej jest ograniczona (taka sama lub podobna), ograniczając naturalną mutację miejsc NMPylacji nsp9 w organizmie i potwierdzając kluczową rolę tej odpowiedzi w cyklu życiowym koronawirusów.
W ostatnim zestawie eksperymentów wyprodukowaliśmy C-końcowy His6 znakowany SARS-CoV-2 nsp12 i nsp9 oraz dwie zmutowane formy nsp12 w E. coli.Zamiast tego reszty miejsca aktywnego w domenach NiRAN i RdRp stosowano odpowiednio Ala (Rysunek 6A i dodatek SI, Tabela S2).K4465 w SARS-CoV-2 nsp12 odpowiada K4135 w HCoV-229E (załącznik SI, rysunek S2), co okazało się wymagane do aktywności NiRAN i replikacji HCoV-229E (rysunek 3D i E).Reszta ta odpowiada także reszcie wirusa tętniczego EAV nsp9 K94, co do której wcześniej wykazano, że jest niezbędna do samoUMPylacji/samo-GMPylacji NiRAN (16).Jak pokazano na Figurze 6B, SARS-CoV-2 nsp12 wykazuje aktywność transferazy UMP przy użyciu nsp9 jako substratu, podczas gdy mutant miejsca aktywnego nsp12_K4465A jest nieaktywny.Podwójne podstawienie w sekwencji charakterystycznej SDD motywu C RdRp nie wpływa na aktywność transferazy UMP (Figura 6B), wskazując, że aktywność RdRp nie ma bezpośredniego wpływu na UMPylację nsp9.Podobne dane uzyskano stosując CTP, GTP i ATP (załącznik SI, rysunek S10).Podsumowując, dane te wskazują, że NMPylacja nsp9 za pośrednictwem NiRAN ma konserwatywną aktywność w koronawirusach reprezentujących różne rodzaje podrodziny ortokoronawirusów.
NMPylacja nsp9 za pośrednictwem SARS-CoV-2 za pośrednictwem nsp12.(A) Żel SDS-poliakryloamidowy barwiony Coomassie pokazujący rekombinowane białko stosowane w teście NMPylacji.Jako kontrolę zastosowano zmutowane białko z podstawieniem miejsca aktywnego w domenie NiRAN (K4465A) i domenie RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Numeracja reszt opiera się na pozycji w pp1ab.(B) Autoradiogram wykrywania UMPylacji przy użyciu nsp9-His6 i [α-32P]UTP jako substratu nsp12-His6 (typ dziki [wt] i mutant).Masę cząsteczkową (w kilodaltonach) znakowanego białka pokazano po lewej stronie.
Domeny NiRAN są na ogół konserwatywne w Nidovirales (16), co wskazuje, że katalizują reakcje enzymatyczne niezbędne do replikacji Nidowirusa.W tym badaniu byliśmy w stanie udowodnić, że domena NiRAN wirusa przenosi NMP (wygenerowany z NTP) na nsp9, tajemnicze białko wiążące RNA zaangażowane w replikację wirusa (26–29), aby określić je jako naturalny cel i partner koronawirusowej RTC.
Domena NiRAN ma trzy motywy sekwencji (AN, BN i CN), które zawierają bardzo małą liczbę reszt, które są konserwatywne we wszystkich rodzinach w monofiletycznym, ale wysoce zróżnicowanym porządku Nidovirales (8, 16).Ostatnie badania wykazały, że są one strukturalnie powiązane z w dużej mierze niescharakteryzowaną rodziną białek kinaz białkowych, które pierwotnie nazywano rodziną SelO (17, 19, 22, 30, 31).Białka związane z SelO mają fałdy kinazowe, ale brakuje im kilku konserwatywnych reszt miejsca aktywnego w klasycznych kinazach (22, 32).W oparciu o odwrotną orientację cząsteczek ATP związanych z miejscem aktywnym i stabilizowanych przez specyficzne interakcje, postawiono hipotezę, że SelO przenosi AMP (zamiast fosforanu) na substrat białkowy (22), podczas gdy inne bakteryjne białko podobne do SelO YdiU ma ostatnio wykazano, że katalizuje kowalencyjne przyłączenie UMP do reszt Tyr i His różnych substratów białkowych (33).
Aby potwierdzić i rozszerzyć przewidywania dotyczące domniemanych reszt miejsca aktywnego domeny NiRAN wirusa korony, wykorzystaliśmy metody biochemiczne i genetykę odwrotną do przeprowadzenia analizy mutacji w koronawirusie nsp12 (rysunek 3D oraz załącznik E i SI, rysunek S3 i tabela) S1â S4).Dane pokazują, że zastąpienie HCoV-229E K4135, R4178 i D4280 Ala eliminuje aktywność transferazy NMP in vitro i replikację wirusa w hodowli komórkowej (rysunek 3D oraz załączniki E i SI, rysunek S3), potwierdzając ich obecność w γ-fosforanie NTP (K4135, R4178) i koordynacja jonów metali w centrum aktywnym (D4280).Wykazano, że substytucja E4145A konserwatywnego Glu w zakresie wirusa ptasiego gniazda, który przewiduje stabilizację pozycji K4135 (17), eliminuje replikację wirusa, ale co zaskakujące, aktywność została zachowana w teście NMPylacji in vitro (Figura 3D i E oraz załącznik SI, rysunek S3 i tabele S1–S4).Podobną obserwację poczyniono, gdy wprowadzono odpowiednią substytucję w homologu YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Podsumowując, dane te potwierdzają raczej funkcję regulacyjną tej konserwatywnej pozostałości niż funkcję katalityczną.
Zastąpienie konserwatywnej reszty Phe (F4281A) w zasięgu nestowirusa w domenie NiRAN HCoV-229E (8) spowodowało spadek aktywności NMPylacji in vitro i znaczny spadek replikacji wirusa w hodowli komórkowej (Rysunek 3D, E i SI) dodatek, rysunek S3).Dane są zgodne z ważną funkcją regulacyjną tej reszty, taką jak pokazana wcześniej reszta Phe z homologicznym motywem DFG.W klasycznych kinazach białkowych stanowi część pętli wiążącej Mg2+ i pomaga w montażu i regulacji kręgosłupa???Wymagany do skutecznego działania katalitycznego (32, 34).Podstawienie reszt K4116 odpowiednio Ala i Arg (w motywie preAN) wyeliminowało replikację wirusa i zgodnie z oczekiwaniami miało różny wpływ na aktywność transferazy NMP in vitro, w zależności od wprowadzonego łańcucha bocznego aminokwasu (Rysunek 3D oraz załączniki E i SI , rysunek S3).Dane funkcjonalne są zgodne z informacjami strukturalnymi, co wskazuje, że reszta ta nawiązała interakcję z fosforanem ATP (17).W domenie NiRAN innych zagnieżdżonych rodzin wirusów, pozycja HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 jest zajęta przez Lys, Arg lub His (8), co wskazuje, że ograniczenia funkcjonalne tej specyficznej reszty zostały złagodzone.Podstawienie D4188A i D4283A eliminuje lub silnie zmniejsza aktywność enzymu i eliminuje replikację wirusa (Rysunek 3).Te dwie reszty są konserwatywne w większości (ale nie we wszystkich) wirusach zagnieżdżonych (8), co wskazuje na ważną, specyficzną dla rodziny funkcję, ale prawdopodobnie niekatalityczną.Jako kontrole zastosowano podstawienia Ala kilku innych reszt Lys i Asp (K4113A, D4180A, D4197A i D4273A), które nie są konserwatywne w rodzinach Coronaviridae lub innych rodzinach Nestioviridae (8).Zgodnie z oczekiwaniami, substytucje te są w dużej mierze tolerowane, z niewielkim spadkiem aktywności enzymatycznej i replikacji wirusa w niektórych przypadkach (Rysunek 3 i załącznik SI, Rysunek S3).Ogólnie rzecz biorąc, dane dotyczące mutagenezy koronaawirusa są bardzo spójne z danymi dotyczącymi self-GMP i genetyki odwrotnej EAV NiRAN-RdRp (16), w których reszta K94 EAV nsp9 (ortolog koronawirusa nsp12) (odpowiadająca HCoV-229E K4135) odgrywa ważne funkcje), R124 (odpowiada R4178), D132 (odpowiada D4188), D165 (odpowiada D4280), F166 (odpowiada F4281).Ponadto dane dotyczące mutagenezy HCoV-229E są zgodne i rozszerzone z wcześniej zgłoszonych danych dotyczących odwrotnej genetyki SARS-CoV (16), podobnie jak te obserwowane dla odpowiedniego motywu CN, mutanta Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12. opisany fenotyp -F219A i HCoV-229E_F4281A (Rysunek 3 D i E oraz dodatek SI, Rysunek S3 i Tabela S1-S4).
W porównaniu z ortologami EAV (16), którzy wyraźnie preferują UTP i GTP (w reakcji auto-NMPylacji), nasze badanie pokazuje, że domena NiRAN wirusa (reprezentowana przez HCoV-229E i SARS-CoV-2) może być skutecznie przeniesione Wszystkie cztery NMP, chociaż istnieje niewielka preferencja dla UMP (rysunki 1 i 3).Stosunkowo niska specyficzność specyficznego kosubstratu NTP jest zgodna z niedawno opisaną strukturą superkompozytową SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, w której ADP-Mg2+ wiąże się z miejscem aktywnym NiRAN, ale nie z adeniną Część powstawania specyficznych interakcji (17).W naszym badaniu rodzaj nukleotydu użytego w reakcji NMPylacji nie ma zróżnicowanego wpływu na aktywność zmutowanego białka (Załącznik SI, Rysunek S3), co wskazuje, że żadna z tych reszt nie jest ściśle związana z wiązaniem określonej zasady nukleinowej.Podstawa strukturalna i potencjalne znaczenie biologiczne różnych preferencji kosubstratów NTP obserwowanych w domenach NiRAN koronawirusów i wirusów tętniczych pozostają do zbadania;mogą być prawdziwe lub mogą wynikać z ograniczeń odpowiednich badań.Obecnie nie można wykluczyć, że potencjalna aktywność NMPylatora domeny NiRAN wirusa tętniczego (w porównaniu z wcześniej scharakteryzowaną aktywnością auto-NMPylacji) ma inną preferencję kosubstratu, biorąc pod uwagę podobieństwo między domeną tętniczą i koronawirusem Domena NiRAN osiągnęła swój limit.Porównanie oparte na sekwencji (16).W porównaniu z pseudokinazą SelO, która wykorzystuje Mg2+ jako kofaktor, aktywność wirusa koronowego i tętniczego NiRAN jest zależna od Mn2+ (16) (Rysunek 3C i załącznik SI, Rysunek S1).Zależność od Mn2+ i oczywista preferencja dla UTP to niezwykła cecha białkowych NMPylatorów i dopiero niedawno została potwierdzona w białku YdiU Salmonella typhimurium, które katalizuje ściśle zależną od Mn2+ UMPylację białka opiekuńczego w celu ochrony komórek przed indukcją stresu. Pula komórkowa ATP ( 33).
Niedawno opisane podobieństwo strukturalne między domeną NiRAN wirusa koronowego a komórkowymi kinazami białkowymi (17, 19) zapewnia dodatkowe wsparcie dla zdolności NiRAN do kowalencyjnego łączenia NMP z innymi białkami, które opisaliśmy w tym badaniu.Nasze poszukiwania możliwych celów NiRAN skupiliśmy na białkach kodowanych przez HCoV-229E ORF1a, o których wiadomo, że bezpośrednio lub pośrednio wspomagają replikazę kodowaną przez ORF1b RTC (12, 35).Nasze eksperymenty dostarczają niezbitych dowodów na skuteczną i specyficzną NMPylację nsp9 (Rysunek 2).Jeżeli docelowe białko stosuje się w nadmiarze molowym 8 do 10 razy większym niż enzym (nsp12), potwierdza się, że nsp9 jest całkowicie (mono)NMP (Rysunek 4).Doszliśmy do wniosku, że interakcja między nsp12 i nsp9 jest krótkotrwała i nie utworzy stabilnego kompleksu z nsp9 (przy braku innych podjednostek RTC).Wniosek ten potwierdzają badania interakcji białek w proteomie SARS-CoV (35).Analiza MS zidentyfikowała aminę pierwszorzędową N-końcowej reszty nsp9 jako miejsce NMPylacji (załącznik SI, rysunek S5).Tworzenie wiązania fosforoamidowego i N-końcowej grupy aminowej odróżnia aktywność NMPylacji za pośrednictwem NiRAN od reakcji AMPylacji za pośrednictwem Pseudomonas syringae za pośrednictwem SelO, która katalizuje tworzenie O-połączonego AMP przy resztach Ser, Thr lub Tyr Addukt peptydowy ( 22), a S. typhimurium YdiU tworzy O-połączone (z Tyr) i N-połączone (z His) addukty peptyd-UMP.Ograniczone informacje dostępne na temat rodziny białek SelO wskazują, że członkowie tej dużej rodziny białek znacznie różnią się pod względem tworzenia adduktów peptyd-NMP.Jest to interesująca obserwacja, która zasługuje na dalsze badania.
Dane uzyskane w tym badaniu doprowadziły nas do postawienia hipotezy, że NMPylacja nsp9 wymaga wolnego końca N.W kontekście replikacji wirusa zostanie to zapewnione przez proteolityczne rozszczepienie miejsca przetwarzania nsp8|nsp9 w poliproteinie replikazy pp1a, w której pośredniczą Mpro i pp1ab.W większości koronawirusów różnica między tym konkretnym miejscem (VKLQ|NNEI w HCoV-229E) a wszystkimi innymi miejscami cięcia Mpro koronawirusów polega na tym, że Asn (a nie inna mała reszta, taka jak Ala, Ser lub Gly) zajmuje P1â???Lokalizacja (36).Dane dotyczące rozszczepienia peptydu uzyskane we wczesnych badaniach wykazały, że skuteczność cięcia miejsca nsp8|nsp9 była niższa niż w przypadku innych miejsc, co wskazuje, że 1) to specyficzne miejsce może odgrywać rolę regulacyjną w terminowym skoordynowanym przetwarzaniu C-końcowego pp1a lub 2) a Rola specjalnie konserwowanego N-końca nsp9 w replikacji wirusa (37).Nasze dane (Figura 5A) pokazały, że rekombinowana forma nsp9 niosąca rzeczywistą sekwencję N-końcową została skutecznie NMPizowana przez nsp12.N-końcową sekwencję flankującą usunięto za pomocą czynnika Xa (nsp9-His6; dodatek SI, tabela S1) lub rozszczepienie za pośrednictwem Mpro (nsp7-11-His6; figura 5A i dodatek SI, tabela S1).Co ważne, niecięty prekursor nsp7-11-His6 zawierający nsp9 wykazywał oporność na NMPylację nsp12, co jest zgodne z naszymi danymi, wskazując, że addukt nsp9-NMP tworzy się przez N-końcową pierwszorzędową aminę (załącznik SI, rysunek S5) .Aby uzyskać głębsze zrozumienie specyficzności substratu NiRAN, skupiliśmy się następnie na sąsiednich resztach N-końcowych nsp9.W przypadku braku innych białek są one strukturalnie elastyczne, co uniemożliwia wykrycie ich w nieznakowanej formie nsp9 (26 28, 38), co wskazuje na ich ograniczoną naturalną zmienność. Wynika to z ważnej specyficznej sekwencji (nie związanej ze strukturą drugorzędową) funkcja N-końcowego fragmentu nsp9.Podstawienia Ala konserwatywnych reszt w tym regionie (rysunki 5C i D oraz dodatek SI, rysunek S8) ujawniają, że N3826 jest niezbędny do NMPylacji nsp9 in vitro, podczas gdy podstawienia N3825A i E3827A prowadzą do zmniejszenia NMPylacji, podczas gdy podstawienia M3829A i P3830A nie .Oczywiście wpływa na NMPylację nsp9.Chociaż podstawienie N-końcowego Asn (N3825A, N3825S) ma jedynie umiarkowany wpływ na NMPylację nsp9 i replikację wirusa w hodowli komórkowej (Figura 5C i D), delecja sekwencji reszty Asn z N-końcowego dipeptydu 3825-NN okazał się śmiertelny dla wirusów, co wskazuje, że wymagana jest jedna reszta Asn przed inną resztą na N-końcu, najlepiej Asn, chociaż wydaje się, że podstawienie podobnych reszt może być częściowo tolerowane (Rysunek 5B, C i D).Wnioskujemy, że dipeptyd 3825-NN, zwłaszcza konserwatywna i niezbędna reszta N3826 w zakresie koronaawirusa (załącznik SI, rysunek S6), zapewnia prawidłowe wiązanie i orientację N-końca nsp9 w miejscu aktywnym NiRAN.
Zastąpienie konserwatywnego Glu wszystkich podrodzin Ala (E3827A) pozwala zachować NMPylację nsp9 in vitro, ale jest śmiertelne dla wirusów w hodowli komórkowej (Rysunek 5C i D), co wskazuje na dodatkową funkcję tej reszty, na przykład w kluczowych interakcjach (NMPylowany lub niezmodyfikowany ) N-koniec nsp9 i inne czynniki biorące udział w replikacji wirusa.Mutacje Nsp9 nie wpływają na proces proteolityczny nsp9 ani żadnego sąsiedniego nsp (39) (Załącznik SI, Rysunek S9), co wskazuje, że śmiertelne fenotypy kilku zaobserwowanych mutacji nsp9 nie były spowodowane rozregulowaniem obszaru pp1a końca procesu proteolitycznego C .
Powyższe dane dostarczają dowodów, że po traktowaniu za pośrednictwem Mpro miejsca cięcia nsp8|9 w pp1a/pp1ab, N-koniec nsp9 może zostać UMPylowany (lub częściowo zmodyfikowany innym NMP).Ponadto doskonała konserwacja końca N nsp9 (w tym pojedynczych i niezmiennych reszt Asn w rodzinie koronawirusów) oraz dane dotyczące odwrotnej genetyki uzyskane w tym badaniu (ryc. 3E i 5D) doprowadziły nas do wniosku, że opisana NMPylacja nsp9 jest biologicznie pokrewny i niezbędny do replikacji koronaawirusa.Funkcjonalne konsekwencje tej modyfikacji pozostają do zbadania, na przykład w odniesieniu do wcześniej opisanej (niespecyficznej) aktywności wiązania RNA nsp9 (postać niezmodyfikowana) (2628).N-końcowa NMPylacja może również wpływać na interakcję nsp9 z substratami białkowymi lub RNA lub na tworzenie różnych czteropoziomowych zespołów.Zaobserwowano je w badaniach strukturalnych i potwierdzono, że są one funkcjonalnie powiązane z replikacją koronaawirusa, chociaż szczególnie w przypadku braku tej modyfikacji (26–29, 40).
Chociaż specyficzność docelowa domeny NiRAN wirusa koronowego nadal wymaga bardziej szczegółowego scharakteryzowania, nasze dane pokazują, że specyficzność docelowej białka domeny NiRAN koronaawirusa jest bardzo wąska.Chociaż zachowanie kluczowych reszt miejsca aktywnego (8, 16) w domenie NiRAN wszystkich rodzin nidowirusów silnie wspiera aktywność konserwatywnego NMPylatora tych białek, tożsamość reszt kieszonkowych wiążących substrat tej domeny. Konserwacja i konserwacja pozostają do scharakteryzowania i mogą różnić się w zależności od celów różnych rodzin Nidovirales.Podobnie nie określono jeszcze odpowiednich celów innych zagnieżdżonych wirusów.Mogą to być odległe ortologie nsp9 lub innych białek, ponieważ sekwencje poza pięcioma domenami replikazy, które są na ogół konserwatywne w wirusach zagnieżdżonych, są mniej konserwatywne (8), włączając w to macierz genomu pomiędzy Mpro i NiRAN. Wśród nich nsp9 znajduje się w korona wirus.
Ponadto nie możemy obecnie wykluczyć możliwości, że domena NiRAN ma dodatkowe cele (w tym komórkowe).W tym przypadku warto wspomnieć, że homologi bakteryjne w tym powstającym białku NMPylatory (NMPylatory) (30, 31) wydają się mieć „główne regulatory”?NMP moduluje różne białka komórkowe w celu regulacji lub eliminacji ich dalszych działań, odgrywając w ten sposób rolę w różnych procesach biologicznych, takich jak komórkowa odpowiedź na stres i homeostaza redoks (22, 33).
W tym badaniu (rysunki 2 i 4 oraz załącznik SI, rysunki S3 i S5) byliśmy w stanie udowodnić, że nsp12 przeniosło część UMP (NMP) na pojedynczą (konserwatywną) pozycję w nsp9, podczas gdy inne białka nie zostały zmodyfikowane w stosowany W tych warunkach wspierana jest dobrze określona (a nie luźna) specyficzność substratu.Zgodnie z tym, w porównaniu z N-końcową NMPylacją nsp9, własna aktywność NMPylacji nsp12 jest bardzo niska, jej wykrycie wymaga dłuższego czasu ekspozycji autoradiografii i wykorzystuje się 10-krotny wzrost stężenia nsp12.Ponadto nasza analiza MS nie dostarczyła dowodów na NMPylację nsp12, co sugeruje, że samo-NMPilacja domeny NiRAN jest (w najlepszym wypadku) działaniem wtórnym.Należy jednak zauważyć, że inne badania dostarczyły wstępnych dowodów na to, że stan samoAMPylacji bakteryjnego NMPylatora może kontrolować ich aktywność NMPylacji na innych substratach białkowych (22, 33).Dlatego potrzebne są dalsze badania w celu zbadania możliwych skutków funkcjonalnych aktywności samo-NMPylacji zgłaszanych dla EAV nsp9 (16) i koronaawirusa nsp12 (to badanie), w tym proponowanego wpływu opiekuńczego na zwijanie C-końcowej domeny RdRp ( 16) ).
Wcześniej rozważano kilka hipotez dotyczących możliwych dalszych funkcji nidowirusowej domeny NiRAN, w tym ligazy RNA, transferazy guanylanowej zakończonej RNA i aktywności starterowej białka (16), ale żadna z nich nie jest zgodna z dostępnymi dalszymi funkcjami.Informacje uzyskane w kolejnych pozycjach są dokładnie takie same, bez dokonywania dodatkowych założeń.Dane uzyskane w tym badaniu są najbardziej spójne (ale nie mogą udowodnić), że domena NiRAN bierze udział w inicjacji syntezy RNA indukowanej białkiem.Wcześniej sądzono, że funkcja domeny NiRAN w 5?Nie mają one wpływu na reakcje czapeczkowania ²-RNA lub ligacji RNA. Potwierdzenie innych danych.Dlatego na przykład uważa się, że miejsce aktywne NiRAN obejmuje konserwatywne Asp jako ogólną zasadę (D252 w Pseudomonas syringae SelO; D4271 w HCoV-229E pp1ab; D208 w SARS-CoV-2 nsp12) (Załącznik SI, rysunek 2 ).S2) (17, 22, 33), podczas gdy kataliza w zależnej od ATP ligazie RNA i enzymie zamykającym RNA jest przeprowadzana przez kowalencyjny enzym-(lizylo-N)-NMP będący związkiem pośrednim, który obejmuje niezmienioną resztę Lys ( 41).Ponadto niezwykła specyficzność wirusa NiRAN oparta na sekwencji w stosunku do konserwatywnych celów białkowych i złagodzona specyficzność w stosunku do kosubstratów NTP (preferuje UTP) przeciwstawia się enzymowi czapeczkującemu za pośrednictwem NiRAN lub funkcjom podobnym do ligazy RNA.
Oczywiście potrzeba dużo dodatkowej pracy, aby zweryfikować i, jeśli zostanie to udowodnione, rozwinąć możliwą rolę nsp9-UMP (nsp9-NMP) w syntezie RNA indukowanej białkiem, co połączy kilka interesujących, ale (jak dotąd) raportów zgłoszonych wcześniej .Pojedyncze obserwacje.Na przykład ustalono, że koniec ujemnej nici RNA wirusa koronowego zaczyna się od nici oligo(U) (42, 43).Obserwacja ta jest zgodna z koncepcją, że synteza RNA o ujemnej nici jest inicjowana przez związanie UMPylowanej formy nsp9 z ogonem poli(A) (wyzwalacze), co może być wspomagane przez wiązanie się z RNA. Aktywność i/lub interakcja z inne białko RTC.Część UMP dostarczoną przez nsp9 można następnie zastosować jako „starter” do oligourydylacji za pośrednictwem nsp7/8/nsp12, stosując ogon 3??²-poli(A) w genomowym RNA lub inną sekwencję zawierającą oligo (A) służy jako matryca, podobnie do mechanizmu ustalonego dla białka VPg pikornawirusa (44).A co jeśli propozycja jest „nienormatywna”????Zainicjowanie (indukowanej białkiem) syntezy RNA o ujemnej nici stanowi powiązanie z obserwacjami wskazującymi, że RNA o ujemnej nici wirusa koronaawirusa ma na końcu UMP (zamiast UTP) (42), co uważa się za wskazujące, że kwas nukleinowy Dicer odcina koniec fosforylowany przez nieznaną endonukleazę specyficzną dla urydyny.Jeśli zostanie to potwierdzone, ta aktywność hydrolityczna kwasu nukleinowego może pomóc w uwolnieniu oligomerycznej UMPylowanej formy nsp9 z końca 5 ² powstającej nici ujemnej.Możliwa rola nsp9 w starterowaniu białek jest również zgodna z wcześniejszymi badaniami nad genetyką odwrotną, które wykazały, że nsp9 (i nsp8) oddziałują krytycznie i specyficznie z konserwatywnym elementem RNA działającym w układzie cis w pobliżu trzeciego końca genomu wirusa koronowego.45).Według tego raportu te wcześniejsze obserwacje można teraz ponownie zbadać i rozszerzyć w drodze dalszych badań.
Podsumowując, nasze dane określiły specyficzną aktywność zastrzeżonego zagnieżdżonego znacznika enzymatycznego wirusa połączonego z RdRp na N-końcu.W koronawirusie ta nowo odkryta aktywność UMPylator/NMPylator za pośrednictwem NiRAN opiera się na Mn2+ i sąsiadujących resztach Asn i powoduje tworzenie (niskoenergetycznych) wiązań fosforoamidowych z N-końcową pierwszorzędową aminą.Dzięki rozszczepieniu za pośrednictwem Mpro w miejscu cięcia nsp8|9, cel nsp9 można zastosować do NMPylacji, wskazując funkcjonalne sprzężenie pomiędzy proteazą i domeną NiRAN, która rozciąga się do RdRp.Konserwacja kluczowych reszt w miejscu aktywnym NiRAN nsp12 i docelowym nsp9, w połączeniu z danymi uzyskanymi z dwóch koronawirusów, w tym SARS-CoV-2, dostarcza mocnych dowodów na to, że NMPylacja nsp9 jest koronawirusem. Cechy konserwatywne są również kluczowym etapem replikacji wirusa.Dostępne dane prowadzą nas do wniosku, że specyficzna rola NMPilowanej formy nsp9 w indukowanej białkiem syntezie RNA jest rozsądnym scenariuszem w przypadku koronaawirusa i innych wirusów zagnieżdżonych, a NiRAN może również atakować inne niezidentyfikowane białka.Reguluj wirusa.Interakcja z gospodarzem.Jeśli zostanie to potwierdzone, udział starterów białkowych w syntezie wirusowego RNA zwiększy powinowactwo sekwencji domen Mpro/3CLpro i RdRp pomiędzy wcześniej wykrytą supergrupą koronawirusową i pikornawirusopodobną (9), które obecnie zostały zunifikowane w niedawno utworzonych Pisonivirites ( 46) w kategorii.
Nasze dane pokazują również, że podstawowe, selektywne i konserwatywne aktywności enzymów zidentyfikowane w tym badaniu można wykorzystać jako cele dla leków przeciwwirusowych.Związki zakłócające wiązanie (i późniejszą modyfikację) konserwatywnego N-końca nsp9 w miejscu aktywnym NiRAN można przekształcić w skuteczne i wszechstronne leki przeciwwirusowe, odpowiednie do leczenia zwierzęcych i ludzkich koronawirusów z różnych (pod)rodzajów Zakażenia , w tym SARS-CoV-2 i koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego.
Sekwencję kodującą białko koronawirusowe wytworzone w tym badaniu amplifikowano metodą RT-PCR przy użyciu RNA wyizolowanego z Huh-7 zakażonego HCoV-229E lub Vero E6 zakażonego SARS-CoV-2 i wstawiono przy użyciu standardowych procedur klonowania.wektor ekspresyjny pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) lub pASK3-Ub-CHis6 (47) (załącznik SI, tabele S1 i S2).Podstawienia pojedynczych kodonów wprowadzono metodą mutagenezy ukierunkowanej opartej na PCR (48).W celu wytworzenia białka fuzyjnego MBP komórki E. coli TB1 transformowano odpowiednim konstruktem plazmidowym pMAL-c2 (załącznik SI, tabela S1).Białko fuzyjne oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa do amylozy i rozszczepiono czynnikiem Xa.Następnie, C-końcowe białko ze znacznikiem His6 oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa z metalem na immobilizowanym Ni (Ni-IMAC), jak opisano wcześniej (49).Do wytworzenia białka fuzyjnego ubikwityny komórki E. coli TB1 zastosowały odpowiedni konstrukt plazmidowy pASK3-Ub-CHis6 (Załącznik SI, Tabele S1 i S2) i plazmidowy DNA pCGI kodujący C-końcową hydrolazę 1 specyficzną dla ubikwityny (Ubp1).Transformacja (47).Białko koronawirusowe ze znacznikiem His6 na C-końcu oczyszczono w sposób opisany wcześniej (50).
Test samo-NMPylacji HCoV-229E nsp12-His6 przeprowadzono zgodnie z opisem w EAV nsp9 (16).W skrócie, nsp12-His6 (0,5 µM) zawiera 50 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM bufor, inkubować określony NTP i 0,17 µM dopasowany [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) w 30°C przez 30 minut.We wszystkich innych (standardowych) testach NMPylacji NMPylacji nsp9 za pośrednictwem nsp12, warunki reakcji dostosowuje się w następujący sposób: nsp12-His6 (0,05 µM) i nsp9-His6 (4 µM) w obecności 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM wskazał NTP i 0,17 µM dopasowany [α32-P]NTP.Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze 30°C próbkę reakcyjną zmieszano z buforem do próbek SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hydroksymetylo)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerol i 0,005% bromofenol niebieski.Białko zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 90°C przez 5 minut i rozdzielono za pomocą 12% SDS-PAGE.Żel utrwala się i barwi roztworem Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% kwas octowy, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), odbarwia i eksponuje na fosforyzujący ekran obrazowy przez 20 godzin (w celu wykrycia nsp12 z NMPylacji). lub (maksymalnie) 2 godziny (w celu oceny NMPylacji nsp9).Do skanowania ekranu wykorzystano kamerę Typhoon 9200 (GE Healthcare), a do analizy intensywności sygnału zastosowano ImageJ.
Do analizy MS zastosowano 1 µM nsp12-His6 i 10 µM nsp9 (bez znacznika heksahistydynowego) w analizie NMPylacji (załącznik SI, tabela S1) i zastosowano zwiększone stężenie 500 µM UTP i GTP.W zależności od ich stężenia i oczekiwanej jakości białka, do odsalania w trybie online od 1 do 10 µl buforowanych roztworów białek zastosowano system HPLC Waters ACQUITY H-Class wyposażony w kolumnę MassPrep (Waters).Odsolone białko eluuje się do źródła jonów przez elektrorozpylanie spektrometru mas Synapt G2Si (Waters) poprzez następujący gradient buforu A (woda/0,05% kwas mrówkowy) i bufor B (acetonitryl/0,045% kwas mrówkowy), a temperatura kolumny wynosi 60°C i szybkość przepływu 0,1 ml/min: elucja izokratyczna 5% A przez 2 minuty, następnie gradient liniowy do 95% B w ciągu 8 minut i utrzymanie 95% B przez kolejne 4 minuty.
Wykrywane są jony dodatnie o zakresie mas od 500 do 5000 m/z.Glu-fibrynopeptyd B jest mierzony co 45 sekund w celu automatycznej korekty dryftu masy.Użyj oprogramowania instrumentu MassLynx z rozszerzeniem MaxEnt1, aby rozłożyć średnie widmo po odjęciu linii bazowej i wygładzeniu.
UMPylowany HCoV-229E nsp9 trawiono przez dodanie zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania (Serva) i inkubowano przez noc w temperaturze 37 ° C.Do odsalania i zatężania peptydów zastosowano kolumnę wirówkową Chromabond C18WP (numer części 730522; Macherey-Nagel).Na koniec peptyd rozpuszczono w 25 µl wody zawierającej 5% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.
Próbki analizowano metodą MS przy użyciu spektrometru masowego Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Najnowocześniejszy system nano™ HPLC (Dionex), wyposażony w niestandardowy, montowany na końcu moduł 50 cm?Kolumna 75 µm C18 RP wypełniona kulkami magnetycznymi o średnicy 2,4 µm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Połączyć się ze spektrometrem mas online poprzez źródło nanosprayu Proxeon;wstrzyknąć 6 µl roztworu trawiącego trypsynę do wewnętrznej średnicy 300 µm ×??Kolumna do wstępnego zatężania 1 cm C18 PepMap (Thermo Scientific).Stosując wodę/0,05% kwas mrówkowy jako rozpuszczalnik, próbkę automatycznie wychwytywano i odsalano przy natężeniu przepływu 6 µl/min.
Zastosowano następujące gradienty woda/0,05% kwas mrówkowy (rozpuszczalnik A) i 80% acetonitryl/0,045% kwas mrówkowy (rozpuszczalnik B) w celu rozdzielenia peptydów trypsynowych przy natężeniu przepływu 300 nL/min: 4% B dla 5 minut, następnie 30 A gradient liniowy do 45% B w ciągu kilku minut i liniowy wzrost do 95% rozpuszczalnika B w ciągu 5 minut.Podłącz kolumnę chromatograficzną do nanoemitera ze stali nierdzewnej (Proxeon) i rozpyl eluent bezpośrednio na podgrzaną kapilarę spektrometru mas, wykorzystując potencjał 2300 V. Powiązany jest skan przeglądowy z rozdzielczością 60 000 w analizatorze mas Orbitrap z co najmniej trzema skanami danych MS/MS, dynamicznie wykluczanymi przez 30 sekund, przy użyciu dysocjacji wywołanej kolizją liniowej pułapki jonowej lub dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii w połączeniu z detekcją orbitrapu. Rozdzielczość wynosi 7500.
Czas publikacji: 03 sierpnia 2021 r